摘  要  GB/T 8313-2002《茶 茶多酚测定》及QB2154-1995《食品添加剂 茶多酚》中均采用酒石酸铁比色法测定茶叶中茶多酚含量。本文对该法检测过程中溶液pH值、样品的粗细、过滤介质的不同等因素对检测结果的影响进行了探讨。

    关键词  酒石酸铁比色法  茶多酚  溶液pH值  样品  过滤介质

    茶多酚是茶叶中益于人类健康的主要有效成分。它含量高（占总干物质的18%-36%）、分布广（植株各器官都含有，但主要集中在嫩叶和嫩芽）、变化大（受内外因的影响最大），对茶叶品质影响最显著，是茶叶生物化学研究最广泛、最深入的一类物质。

    茶多酚的检测方法有多种，其中比较常用的有酒石酸铁比色法、高锰酸钾滴定法和高效液相层析法。GB/T 8313-2002及QB2154-1995《食品添加剂 茶多酚》采用了酒石酸铁比色法的检测方法。该方法简便快速，容易掌握，不但回收率高，重现性好，而且显色稳定性很好。

    笔者所在的云南省临沧市，是云南省最大的茶叶原料基地，与茶叶相关的检验是笔者所在单位工作的重心，每年检验茶叶的样品量就有1000个左右。为此，笔者对影响酒石酸铁比色法检验结果的因素进行了探讨。 

    试验材料与试剂

    1.原理：茶叶中的多酚类物质能与亚铁离子形成紫蓝色络合物。

    2.仪器和用具：实验室常规仪器；分析天平:感量0.0001g；分光光度仪。

    3.试剂和溶液：所有试剂应为分析纯(AR),水为蒸馏水。

    3.1酒石酸亚铁溶液:称取1.0g硫酸亚铁(FeSO4.7H2O)和5.0g酒石酸钾钠(C14H4O6KNa.4H2O),用水溶解并定溶至1L(低温保存有效期10天)。

    3.2 pH7.5磷酸盐缓冲溶液

    3.2.1 1/15mol/L磷酸氢二钠:称取23.9g十二水磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O),加水溶解后定溶至1L。

    3.2.2  1/15mol/L磷酸二氢钾:称取经110℃烘干2小时的磷酸二氢钾（KH2PO4）9.08g,加水溶解后定溶至1L。

    取上述1/15mol/L的磷酸氢二钠溶液85ml和1/15mol/L的磷酸二氢钾溶液15ml混合均匀备用。

    4.操作方法

    4.1 取样按GB/T8302的规定执行,试样制备按GB/T8303的规定执行。

    4.2 试液制备按GB/T8312-2002中11.1的规定执行。

    4.3 测定:准确吸取试液(4.2)1ml,注入25ml的溶量瓶中,加水4ml和酒石酸亚铁溶液(3.1)5ml,充分混合,再加pH7.5磷酸盐缓冲溶液(3.2)至刻度,用10mm比色杯,在波长540mm处,以试亮剂空白溶液作参比,测定吸光度(A)。

    试验方法及结果

    1.pH值对检测结果的影响

    茶叶多酚类物质的羟基能与酒石酸铁溶液产生稳定的紫色，由于连位和邻位羟基对pH值有不同的反应，在pH6.24时连位羟基与铁起反应,而邻位羟基几乎不参加反应；在pH6.8和pH8.1时连位羟基变化不大，颜色的加深是由邻位羟基引起的。pH值低于7.0时，酒石酸铁和磷酸盐缓冲溶液会形成乳浊状，混浊干扰比色结果。从下表可见，酒石酸铁与简单儿茶素在pH值低于6.29时几乎不呈色，pH值大于7.0才开始显色，在pH值8.0后显色最强，但茶多酚在碱性条件下较易氧化，所以显色使用pH7.5的缓冲溶液是最合适的。

表1 pH值对酒石酸铁与茶多酚呈色的影响      *  [*λ=540nm的吸光度（A）值]

    2.样品粗细对检测结果的影响

    取5个茶叶样，操作过程同GB/T 8313-2002的要求。一组为按标准要求磨细的茶叶样品，另一组为直接取样没有磨细的样品，做平行样，检验结果如下（见表2）：

    由表2可见,样品的粗细对检验结果有一定的影响。按标准制样，检测结果就比未制样的茶样要高，所以样品的制作非常关键，这是因为茶叶前处理太粗，茶多酚的浸提可能不太完全，只有按标准制样，茶多酚的浸提才比较彻底，检验结果才能客观。

    此外，样品制作时还必须注意，茶叶样不能磨的太细，如过滤的时候采取的是纱布和脱脂棉，太细的茶叶微尘就会穿过纱布和脱脂棉，增大茶汤在分光光度计上的读数，结果会偏高。

    3.过滤介质的不同对检验结果的影响

    GB/T 8313-1987样品前处理过程中，在过滤茶汤的时候并没有规定过滤介质，如有的实验室用滤纸，有的用尼龙滤布，有的用脱脂棉或其他，就会造成检验结果的不一致。笔者对此做过比对，下面用同样的5个茶叶样，分别用定性快速滤纸和尼龙布过滤，结果如下（见表3）：

    由表3可见，用尼龙滤布过滤后的样品检测结果比用定性快速滤纸过滤后的样品检测结果高约1.5～3.6个百分点，经过分析可能是尼龙滤布孔径较大，茶叶中细小的微尘进入到滤液中，造成溶液的吸光值偏高，检测结果于是偏高。但是用滤纸过滤比尼龙布慢很多，如果样品量较大，又跟不上生产的需求，所以笔者建议今后修改标准时，应规定统一的过滤介质，以免因过滤介质不同造成检测结果的偏差。

    4.茶多酚浸提时的加水量对检测结果的影响

    GB/T 8313-2002中茶多酚的浸提步骤是：加入450ml沸腾的蒸馏水浸提，放入沸水浴中，浸提45分钟，再用50ml水洗涤，冷却定容至500ml。但笔者经实际检验发现，浸提时加入300ml沸腾的蒸馏水，洗涤用水150ml，平行结果非常好。笔者用同样的茶样，分别做了平行（见表4、表5）

    原因分析：用450ml水浸提，洗涤用水仅50ml，因为洗涤不完全，所以造成了平行结果的偏差很大。而采用300ml水浸提，150ml水洗涤，浸提也完全，同时洗涤也彻底，可见这种方法的结果更有说服力。

    5.残渣洗涤用水温度对检验结果的影响

    在茶叶的检验过程中，笔者发现这样一个情况，同样的方法和步骤，换了人做，结果就不一样。笔者仔细对比和研究，发现在洗涤茶叶残渣的时候用水温度不一样，检测结果就不同。如果是刚烧开的水，结果就比较高，不是刚烧开的或者温水，做出的结果就偏低。下面是笔者做的茶叶样的数据对比（见表6、表7）：

    由此可知，茶叶残渣洗涤时一定要用沸水，如果水温度达不到，残渣中附着和含有的茶多酚洗涤得不够和不均匀，造成茶多酚检测结果平行误差过大，所以洗涤用水一定要大于90℃，最好是刚烧开的水。

    6.加完显色剂定容后到上机检测的时间长短对检测结果的影响

    这个细节也是在实际检测工作中发现的，笔者所在单位茶叶检测是最主要产品，样品多的时候忙不过来，有时从茶汤中取样配制好了溶液，却因为没有时间，只好摆放到第二天使用，但是茶多酚是一种易氧化物质，摆放了一天，对结果有没有影响呢？笔者用下面的数据说明（见表8）：

    注: 吸光度波长λ=540nm。

    由此可见,加完显色剂定容后，马上上机检测所得样品吸光值与放置24小时后测得的样品吸光值变化很小，在0.002～0.007之间，故茶多酚检测样品配制好后，放置时间在24小时内，检测结果几乎没有变化，这与茶多酚的强抗氧化性有关，同时加入的pH7.5的磷酸盐缓冲溶液也阻止了它的进一步氧化。这说明配制好的溶液性质相当稳定，对检测结果的影响可以忽略不计。

    7.按标准方法，样品减半称量（称1.5g）、减半定容(250ml容量瓶)对检测结果的影响

    前文讲到用滤纸过滤茶汤速度较慢，跟不上生产的需求，为此，笔者作了如下实验：

    减半称量样品约1.5g，放入250ml容量瓶中，加入热蒸馏水约220ml，沸水浴45分钟，然后冷却定容，取样的时候用小烧杯＋滤纸过滤，弃去第一次滤液，其余步骤同GB/T 8313-2002。这样就避免了把茶汤全部滤出花时间太长的问题，也节省了一半的蒸馏水。以下是笔者所做的比对实验结果（见表9）：

    由表9可知，这种方法在理论上比标准方法更为简单和节省，但是平行结果不太理想，稳定性不太好，规律性不强，大部分样品结果与标准方法相比偏低，少量样品结果又偏高，此方法是否可行还需实验验证。